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L'analisi della
Frazione Insaponificabile

Dott. Francesco Meriani

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olive taggiasche Introduzione

Prima di addentrarci nelle modalità della analisi della frazione lipidica insaponificabile degli olî alimentari vegetali, è utile presentare alcune delle caratteristiche dell'olio di oliva vergine.

Quest'olio è l'unico grasso vegetale che può essere consumato in seguito ad una lavorazione esclusivamente meccanica, ossia priva di interventi chimici.

Gli altri olî invece devono (per legge) essere sottoposti anche a trattamenti diversi dall'estrazione meccanica (subiscono cioè procedimenti di estrazione con solventi, rettificazione, taglio...).

L'olio di oliva vergine, per essere venduto come tale nelle sue quattro diverse "sottoclassi", oltre a non subire estrazioni o "correzioni" chimiche nemmeno deve essere addizionato di altri prodotti o di altri olî.

Da molto tempo quindi si è studiato il modo di rivelare le sofisticazioni, e molte soluzioni sono state trovate.
Il progredire delle conoscenze però, come ha facilitato la ricerca delle sostanze aggiunte di frodo, così ha anche permesso di eseguire nuovi tipi di sofisticazioni, più difficilmente scopribili.
Alcuni saggi classici, usati anche per più di un secolo, sono diventati quindi inefficaci (parzialmente o totalmente) ed è stato necessario sostituirli o affiancarli con nuove procedure, tra le quali una delle più efficaci è l'analisi gas-cromatografica degli steroli, i quali sono una delle componenti della frazione insaponificabile degli olî vegetali.

Uno degli esami più "classici", nato nel 1899, per rilevare l'aggiunta di olî diversi da quello di oliva vergine è il saggio di Bellier (modificato intorno al 1920 da Carocci Buzi) per la ricerca dell'olio di arachide e/o dell'olio di sansa.
Il metodo si basa sulla separazione (in alcool a 70º) di di composti che non ci sono nell'olio di oliva vergine. Tra questi ricordiamo l'acido arachico (C20), lignocerinico (C24) e/o di cere, le quali caratterizzano gli olî di estrazione quali l'olio di sansa.
Accade però che gli oliî di sansa "moderni" sfuggano a tale saggio per via delle loro caratteristiche conseguenti a nuovi processi di produzione: è necessario in tal caso ricorrere alla analisi della frazione insaponificabile (vedasi prossimi paragrafi) in quanto la loro ricerca con il saggio di Bellier Carocci Buzi darebbe esito negativo anche in loro presenza.

L'aggiunta di olî di rettifica all'olio di oliva vergine viene rilevata invece con analisi ai raggi UltraVioletti (gli olî naturali di pressione non contengono doppi legami coniugati, che invece risultano presenti dopo la rettifica) e/o con la gas-cromatografia isoterma sugli esteri metilici dei grassi.

L'analisi della presenza eventuale di olî esterificati artificialmente si effettua al giorno d'oggi tramite gli enzimi pancreatici lipasi con successiva TLC (questo metodo ha soppiantato il precedente che prevedeva la ricerca dell'acido elaidinico, che però non si trova solo negli olî esterificati ma anche in quelli rettificati, il cui uso è talvolta permesso, e ciò rende pressochè inutile la sua ricerca in quanto non si può affermare che l'olio trovato sia esterificato).

Analisi della Frazione Insaponificabile

Questo tipo di analisi è utile al giorno d'oggi per almeno due motivi.
Innanzitutto poichè l'avanzare della scienza ha reso possibili alcuni trattamenti, nella fase finale della rettifica degli olî di sansa, capaci di rendere questi olî "invisibili" agli altri saggi anti-sofisticazione.
Poi perchè ultimamente, grazie alle biotecnologie, sono state ottenute delle varietà di piante che presentano una composizione in acidi grassi molto simile all'olio di oliva, così la frazione insaponificabile rimane una delle (poche) caratteristiche inequivocabilmente distintive di un certo prodotto.
Tra tutti i componenti della frazione insaponificabile si studiano principalmente gli steroli (ma anche eritrodiolo e alcooli alifatici superiori) essendo queste sostanze che caraterizzano qualitativamente e quantitativamente le differenti sostanze grasse.

Gas-cromatografia degli steroli

Diverse tecniche cromatografiche danno diversi risultati: i metodi Ufficiali non sono i più precisi possibile (non separano il delta5-avenasterolo dal picco principale del beta-sitosterolo) ma sono comunque sufficienti a dare risultati utili alla rivelazione di olî sofisticanti. Il modus operandi riguardante il Metodo Ufficiale (modificato per accrescerne il potere risolutivo) è il seguente:
  • preparazione frazione insaponificabile
    10g di sostanza da analizzare vengono posti in una beuta con 100ml di KOH 2N in EtOH e portati ad ebollizione per un ora.
    Successivamente si raffredda fino a 30-35 ºC, si lava con acqua distillata ed etere etilico e si immette in un imbuto separatore.
    Si agita e poi si lascia riposare.
    Dopo separazione sulla fase acquosa si effettuano due ulteriori estrazioni con 50ml di etere etilico; si riuniscono gli estratti in un imbuto separatore e si lavano con 50 ml di acqua per due o tre volte.
  • purificazione frazione insaponificabile con cromatografia su colonna
    Dopo essicamento tramite Na2SO4 anidro si distilla l'etere fino ad ottenere un volume non superiore a 4 ml.
    Si prepara nel frattempo una colonna cromatografica impaccandola con una sospensione uniforme di allumina (10g) ed etere etilico (50ml).
    Successivamente si versano nella colonna la soluzione di etere contenente la frazione insaponificabile, e si lava il contenitore con qualche ml di etere etilico.
    Lavando la colonna con 200 ml di etere etilico otteniamo la frazione insaponificabile, mentre eventuali acidi grassi liberi rimangono adsorbiti nella colonna.
    Per distillazione (sotto vuoto per gli ultimi ml) si elimina l'etere.
  • Separazione dei costituenti tramite cromatografia su strato sottile (TLC)
    Una lastra di vetro di 20x20 cm viene ricoperta da una sospensione omogenea di 40 g di silice in 80 g di acqua, alta 0.25 mm.
    Dopo che la lastra è asciutta (all'aria per un'ora ed in stufa a 120 ºC per due ore) la si può conservare in un apposito essicatore.
    Nel frattempo si prepara una soluzione al 5% della frazione insaponificabile in cloroformio.
    0.3 ml di codesta soluzione vengono strisciati con una microsiringa a 2 cm dal bordo della lastra cromatografica (linea di partenza).
    La corsa si ottiene in solvente esano : etere = 1: 1 fino a 1 cm dal bordo superiore della lastra.
    Una volta che l'analisi TLC si è completata si asciuga la lastra e la si bagna conl sale sodico di 2,7-diClfluorescina O.1% in EtOH (fluorescente nel giallo).
    Si otterrà una cromatografia di questo tipo:
    • fronte + carotenoidi
    • idrocarburi
    • tocoferoli
    • alcooli superiori e triterpenici
    • steroli
    • eritrodiolo e uvaolo
    • start
  • asportazione della banda degli steroli e loro silanizzazione (=> TMSE)
    La banda degli steroli viene asportata con una spatola e viene aggiunta di 25ml di etere etilico.
    Dopo qualche ora di riposo si filtra e a b.m. a 60 ºC si evapora cautamente.
    Infine si seccano gli steroli in stufa a 100 ºC per 10 min.
    Poichè gli steroli non sono adatti ad essere sottoposti direttamente ad una analisi cromatografica, è più opportuno trasformarli nei loro trimetilsilileteri (TMSE) facendoli reagire con 0.2 ml di metilformammide, 0.2 ml di esametildisilazano e 0.2 ml di trimetilclorosilano (a temperatura ambiente per mezz'ora).
  • gas-cromatografia dei TMSE
    L'apparecchio usato è un gas-cromatografo ad alta risoluzione con fase fissa costituita da polimetilfenilsilossano (OV17) al 3% su supporto inerte di Chromosorb W 80-100 mesh, largo internamente 3.5 mm circa e lungo da 2 a 3 metri. Non esiste, data la variabilità delle colonne, un protocollo standard (per esempio si può operare con una camera d'iniezione a 280 ºC e con una colonna a 240 ºC).
  • identificazione e valutazione del contenuto dei vari steroli.
    L'analisi di un olio di oliva genuino deve dare i seguenti valor di steroli:
    • beta-sitosterolo + delta5-avenasterolo 3 94 %
    • campesterolo 3 2.5 % * 4 %
    • stigmasterolo 3 1 % * 2.5 %
    • delta7-stigmasterolo * 1 %
    • colesterolo = 0 % tracce
    NB: nell'olio di sansa la percentuale riferita a beta-sitosterolo + delta5-avenasterolo dev'essere 3 93% (con colonne a maggiore potere risolutivo si può notare che lo sterolo delta5-avenasterolo rappresenta circa il 14% degli steroli totali).


Ricerca degli olî di sansa modificati

Ossia di quegli olî che, privati della loro componente di cere, sfuggono al saggio Belleri - Carocci Buzi.
Ci sono due analisi possibili, uno Ufficiale ed uno no; li vedremo entrambi.
  • Metodo Ufficiale - o metodo dell'eritrodiolo, è utile per rilevare la sofisticazione con olio di sansa modificato.
    L'eritrodiolo e l'uvaolo sono presenti in quantità notevole negli olî di sansa, anche in quelli decerati; nell'olio di oliva vergine o rettificato invece sono presenti in piccola percentuale.
    L'analisi procede in modo identico alla precedente, solo che dalla lastra TLC asciugata si asporta non solo la linea degli steroli ma anche di quella sottostante dell'eritrodiolo e dell'uvaolo.
    La silanizzazione procede in modo indentico.
    Dopo aver ottenuto i picchi dall'analisi cromatografica la percentuale di eritrodiolo e di uvaolo si ottiene dalla espressione sottostante:

    c % = 100 (E1 + E2)/ E1 + E2 + ES

    E1 = area in mm2 del picco dell'eritrodiolo
    E2 = area in mm2 del picco dell'uvaolo
    ES = area in mm2 dei vari picchi degli steroli

    Se c è maggiore del 5% significa che c'è stata un'aggiunta di olio di sansa.

     
  • Metodo basato sul rapporto degli alcooli superiori
    Introduzione
    Quando si allontanano le cere dall'olio di sansa, questo allontanamento avviene più efficacemente per le cere costituite da esteri di alcooli di peso elevato.
    Negli olî non decerati il rapporto tra un alcool C26 (cerilico) ed uno C24 (lignocerilico) è circa 1, mentre negli olî decerati, poichè l'alcool più lungo viene eliminato con resa più alta, il rapporto scende a 0.3 circa.
    Ciò permette di stabilire se un olio decerato è stato aggiunto ad uno naturale.
    Modus operandi
    • preparazione frazione insaponificabile
      10g di sostanza da analizzare vengono posti in una beuta con 100ml di KOH 2N in EtOH e portati ad ebollizione per un ora.
      Successivamente si raffredda fino a 30-35 ºC, si lava con acqua distillata ed etere etilico e si immette in un imbuto separatore.
      Si agita e poi si lascia riposare.
      Dopo separazione sulla fase acquosa si effettuano due ulteriori estrazioni con 50ml di etere etilico; si riuniscono gli estratti in un imbuto separatore e si lavano con 50 ml di acqua per due o tre volte.
    • purificazione frazione insaponificabile con cromatografia su colonna
      Dopo essicamento tramite Na2SO4 anidro si distilla l'etere fino ad ottenere un volume non superiore a 4 ml.
      Si prepara nel frattempo una colonna cromatografica impaccandola con una sospensione uniforme di allumina (10g) ed etere etilico (50ml).
      Successivamente si versano nella colonna la soluzione di etere contenente la frazione insaponificabile, e si lava il contenitore con qualche ml di etere etilico.
      Lavando la colonna con 200 ml di etere etilico otteniamo la frazione insaponificabile, mentre eventuali acidi grassi liberi rimangono adsorbiti nella colonna.
      Per distillazione (sotto vuoto per gli ultimi ml) si elimina l'etere.
    • separazione dei costituenti tramite cromatografia su strato sottile (TLC)
      Una lastra di vetro di 20x20 cm viene ricoperta da una sospensione omogenea di 40 g di silice in 80 g di acqua, alta 0.25 mm.
      Dopo che la lastra è asciutta (all'aria per un'ora ed in stufa a 120 ºC per due ore) la si può conservare in un apposito essicatore.
      Nel frattempo si prepara una soluzione al 5% della frazione insaponificabile in cloroformio.
      0.3 ml di codesta soluzione vengono strisciati con una microsiringa a 2 cm dal bordo della lastra cromatografica (linea di partenza).
      La corsa si ottiene in solvente esano : etere = 1: 1 fino a 1 cm dal bordo superiore della lastra.
      Una volta che l'analisi TLC si è completata si asciuga la lastra e la si bagna conl sale sodico di 2,7-diClfluorescina O.1% in EtOH (fluorescente nel giallo).
      Si otterrà una cromatografia di questo tipo:
      • fronte + carotenoidi
      • idrocarburi
      • tocoferoli
      • alcooli superiori e triterpenici
      • steroli
      • eritrodiolo e uvaolo
      • start
    • asportazione della banda degli alcooli superiori e degli alcooli triterpenici e loro silanizzazione
      la banda degli alcooli superiori e degli alcooli triterpenici viene asportata con una spatola e viene aggiunta di 6ml circa di etere etilico.
      Dopo circa 12 ore di riposo si filtra e in corrente d'azoto si evapora cautamente.
      Infine si essica in stufa a 100 ºC per 10 min. Poichè questi alcooli non sono adatti ad essere sottoposti direttamente ad una analisi cromatografica, è più opportuno trasformarli nei loro trimetilsilileteri (TMSE) facendoli reagire con 0.2 ml di metilformammide, 0.2 ml di esametildisilazano e 0.2 ml di trimetilclorosilano (a temperatura ambiente per mezz'ora).
    • gas-cromatografia dei silanizzati
      L'apparecchio usato è un gas-cromatografo ad alta risoluzione con fase fissa costituita da polimetilfenilsilossano (OV17) al 3% su supporto inerte di Chromosorb W 80-100 mesh, largo internamente 3.5 mm circa e lungo da 2 a 3 metri. Non esiste, data la variabilità delle colonne, un protocollo standard (per esempio si può operare con una camera d'iniezione a 280 ºC e con una colonna a 240 ºC).
    • identificazione e valutazione dei rapporti tra le aree dell'alcool cerilico e dell'alcool lignocerilico.
      Una volta ottenuti i picchi si confronta l'area relativa all'alcool cerilico e quella dell'alcool lignocerilico: valori C26/C24 < 0.9 rivelano la presenza di olio di sansa.
      Altri valori medî relativi al rapporto C26/C24 sono:
      Olio di pressione: 1.3
      Olî rettificati 1.12
      Olî di sansa normali 0.98
      Olî di sansa decerati 0.30
Conclusione

Al giorno d'oggi, per quanto rigurda l'analisi degli olî vegetali, è indispensabile l'analisi della frazione sterolica.

I motivi, come accennato prima, sono da ricercarsi nel fatto che la frazione sterolica non è influenzabile da variazioni genetiche che invece possono mutare radicalmente la componente saponificabile e quella degli acidi grassi.

Dott. Francesco Meriani

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